【科研熱點(diǎn)】腫瘤中的miRNA（二）

miRNAs 是一類由發(fā)卡結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物而形成的短的單鏈非編碼 RNA，長(zhǎng)度一般在 19-25 個(gè) nt。 miRNA 發(fā)揮作用的方式是通過(guò)和編碼蛋白的 mRNA 的 3‘UTR 區(qū)域進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制 mRNA 的翻譯或者直接導(dǎo)致 mRNA 的降解，起到一個(gè)負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的效果。

通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算，研究人員發(fā)現(xiàn)單個(gè) miRNA 平均可以抑制超過(guò) 100 個(gè) mRNA 的表達(dá)（或者降解）。目前在人類中發(fā)現(xiàn)的 miRNA 超過(guò) 2000 個(gè)，從理論上而言，miRNAs 總共可以抑制超過(guò) 20 萬(wàn)個(gè) mRNA，由于 miRNA 的下游靶基因在一 定程度上具有重疊，因此目前的理論認(rèn)為：超過(guò) 60%的人類蛋白編碼基因的 3’UTR 都含有 miRNA 結(jié)合位點(diǎn)。

由此，我們*有理由將 miRNAs 看成是人體內(nèi)較為復(fù)雜及龐大的一大類基因調(diào)控分子?；?miRNAs 對(duì)于基因表達(dá)的強(qiáng)大調(diào)控作用，這類分子在病理情況下也同樣發(fā)揮了重要的作用并不會(huì)讓研究者感到意外（前幾年對(duì)于 miRNAs 研究的追捧也印證了這類分子對(duì)于研究人員的吸引力）?，F(xiàn)在就miRNA在腫瘤中的作用進(jìn)行一次較為全面的梳理和介紹。

miRNA 的生物合成及功能 

整個(gè) miRNA 在體內(nèi)的生物合成過(guò)程始于細(xì)胞核，終于胞質(zhì)，可以將整個(gè) miRNA 的生物合成過(guò)程分為三個(gè)主要的事件：收獲（cropping），核轉(zhuǎn)運(yùn)（nuclear export）及修剪（dicing）【參考文獻(xiàn) 1-4】。

首先，含有 miRNA 序列的基因通過(guò) RNA 聚合酶 II（Pol II）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成帶有 5'帽子（5'cap） 及 3'PolyA 結(jié)構(gòu)的原始 miRNA 分子（primary miRNAs，pri-miRNAs）。這類 pri-miRNAs 長(zhǎng)度往往有幾個(gè) kb 長(zhǎng)，通常呈現(xiàn)出莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem-loop），而成熟的 miRNA 序列則包含在這些莖環(huán)結(jié)構(gòu)中。

在原始 miRNAs（pri-miRNAs）向成熟的 miRNA 形成過(guò)程中，首先發(fā)揮作用的是 Drosha/DGCR8  異源二聚體（heterodimer）。它的作用切割原始 miRNAs 的莖環(huán)并形成長(zhǎng)度約 60-100nt 的呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（hairpin-structure）的前體 miRNA（precursor-miRNA，pre-miRNAs）。從原始 miRNAs 中切割出發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體 miRNAs 的過(guò)程，被稱為收獲（cropping）。

呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體-miRNA 可以被 Exportin-5（XPO5）及其協(xié)同蛋白 Ran-GTP 所識(shí)別，并將前體-miRNA 從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿內(nèi)。 

前體-miRNA 在胞漿內(nèi)被 RNase III 酶 Dicer 所切割，并釋放長(zhǎng)度約 22 nt 的雙鏈 miRNA。人體內(nèi) Dicer 酶可以和兩個(gè)相關(guān)的蛋白相互作用，一個(gè)是 TRBP（transactivation response RNAbindingprotein）；另一個(gè)是 PACT（proteinactivator of the interaction, 也有被稱為 PRKRA）。 之所以要提到 TRBP 和 PACT 這兩個(gè)分子，不是因?yàn)樗鼈儗?duì)于 Dicer 酶的活性有影響，而是因?yàn)檫@兩個(gè)分子會(huì)影響 miRNA 的功能。但是 TRBP 和 PACT 介導(dǎo)的詳細(xì)分子機(jī)制還不清楚。

當(dāng)雙鏈 miRNA 形成后，它們和 Argonaute（Ago）相互作用，從而形成 RISC 復(fù)合物（RNAinduced silencing complex，RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）。兩條 RNA 鏈中的一條鏈保持和 Ago 蛋白的結(jié)合，這條鏈就是成熟的 miRNA（有時(shí)也被稱為導(dǎo)向鏈，guide strand ）；另一條鏈（有時(shí)也被稱為 passenger strand 或者用 miRNA*表示）被降解。miRNA 通過(guò)與靶標(biāo) mRNA 的結(jié)合，將 Ago 蛋白靶向至靶標(biāo) mRNA。

由于 miRNA 是通過(guò)調(diào)控靶標(biāo) mRNA 后發(fā)揮作用的，因此如何發(fā)現(xiàn)及鑒定 miRNA 下游的靶標(biāo) mRNA 是該研究領(lǐng)域內(nèi)較為重要的課題和方向。

在預(yù)測(cè) miRNA 下游靶標(biāo)的領(lǐng)域內(nèi)，最新的計(jì)算機(jī)算法會(huì)考慮如下的因素： 

1）物種間的進(jìn)化保守性； 

2）種子序列； 

3）靶標(biāo)中的 miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量； 

4）結(jié)合區(qū)域周圍的序列影響。 

現(xiàn)在常見的 miRNA 靶標(biāo)分析算法根據(jù)是否考慮物種間的保守性，可以分為兩大類： 

1）基于物種間保守性的算法和； 

2）不考慮物種間保守性的算法。

目前常用的 miRNA 下游靶基因預(yù)測(cè)的軟件/算法都是基于物種間保守性的，常見的算法/網(wǎng)站，包括 miRanda，PicTar，TargetScan 和 DIANA-microT。PITA 和 rna22 算法不僅考慮了物種間的保守性，還考慮了其他的參數(shù)，例如 miRNA 與靶基因結(jié)合的自由能（free energy）及結(jié)合區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

盡管 miRNA 的靶基因在持續(xù)地發(fā)現(xiàn)，但是考慮到至少 60%的基因都可能受到 miRNAs 的調(diào)控，目前所發(fā)現(xiàn)的受到 miRNA 調(diào)控的靶基因依然只是極少部分。因此，如何有效、快速地發(fā)現(xiàn) miRNAs 下游的靶基因，不僅是一個(gè)科學(xué)問(wèn)題，更可以加深我們對(duì)于 miRNA 調(diào)控機(jī)制的研究并指導(dǎo)我們開發(fā)具有治療意義的 miRNA 靶標(biāo)。

【參考文獻(xiàn)】： 

1、Kim VN, HanJ, Siomi MC. 2009. Biogenesis of small RNAs in animals.  Nat. Rev. Mol. CellBiol. 10:126–39 

2、Kim VN. 2004. MicroRNA precursors in motion: Exportin-5 mediates  theirnuclear export. Trends Cell Biol. 14:156–59 

3、Kim VN. 2005. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and dicing.  Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6:376–85 

4、Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN. 2002. MicroRNA maturation:  stepwiseprocessing and subcellular localization. EMBO J. 1:4663–70