分享染色質(zhì)免疫共沉淀的方法

目前，不斷發(fā)展的DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法和技術(shù)已經(jīng)成為研究DNA復(fù)制、重組、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄的核心。今天跟大家分享的是花樣百出、拽酷炫的染色質(zhì)免疫共沉淀的方法！

染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,  CHIP)原理

值得注意的是，它是目前*個研究體內(nèi) DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。在生理狀態(tài)下，把細(xì)胞內(nèi)的 DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的 DNA 片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的 DNA 片段，再通過多種下游檢測技術(shù)（定量 PCR、基因芯片、測序等）來檢測此富集片段的 DNA 序列。

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)包括 3 個獨立的步驟，即固定、沉淀和檢測。

第 1 步為固定，即在體內(nèi)用甲醛固定 DNA 和蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機械（超聲波）的手段將其隨機切成一定長度的染色質(zhì)小片段（200～1000bp）。

第 2 步為免疫沉淀，即利用目的蛋白質(zhì)或者目的蛋白質(zhì)上標(biāo)簽的特異性抗體，通過抗原和抗體反應(yīng)形成 DNA-蛋白質(zhì)－抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段。

第 3 步為目的片段的純化與檢測，即經(jīng)過熱處理解交聯(lián)，釋放共沉淀的 DNA；再將 DNA 片段純化后，對沉淀的 DNA 樣品進(jìn)行檢測。

目前檢測方法主要有 3 種：

染色質(zhì)免疫共沉淀-qRT(ChIP-qRT)

第 1 種是比較沉淀的模版與陰性和陽性對照信號強度的相對精確的定量 PCR 方法。有關(guān)這個方法，跟其他兩種相比，只想送給愛學(xué)習(xí)愛動手的小伙伴四個字：成本較低！

染色質(zhì)免疫共沉淀芯片雜交(ChIP-chip)

ChIP 和 DNA 微陣列芯片技術(shù)的結(jié)合是一種高通量分析 DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合或者翻譯后染色質(zhì)/組蛋白修飾的方法。具體方法是：將經(jīng)過染色質(zhì)免疫共沉淀的 DNA 樣品純化后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，然后用熒光素標(biāo)記（如 Cy3）。對沒有經(jīng)過免疫沉淀反應(yīng)富集的 Input DNA 樣品也進(jìn)行擴(kuò)增，并且用另一種熒光素標(biāo)記（如 Cy5），作為結(jié)合背景的參照。之后將這兩種 DNA 雜交于包括基因組序列的微陣列芯片上，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶序列用每個點相應(yīng)的熒光強度來確定。

染色質(zhì)免疫共沉淀測序法(ChIP-seq)

在測序深度和范圍足夠的情況下, ChIP-seq 可以檢測到所有的組蛋白修飾所對應(yīng)的 DNA  結(jié)合位點。ChIP-seq 首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)特異地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段, 并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建,然后以 NGS 技術(shù)對富集到的 DNA 片段進(jìn)行高通量測序。

【NGS 技術(shù)主要是利用 DNA 新模板的合成或連接過程, 用高效平行的方式同時對 DNA 模板進(jìn)行測序, 從而獲得大量的測序數(shù)據(jù), 即所謂的大規(guī)模平行測序。】

盡管染色質(zhì)免疫共沉淀看上去似乎很高大上，但真正掌握其原理和方法之后其實也不難。何況它的后續(xù)檢測并不都是 chip 和 seq 這些高消費的方法，也可以采用接地氣的 qRT-PCR，小伙伴們可根據(jù)自己的情況作出選擇。