三天征服Chip的經(jīng)驗分享

在科研界，CHIP 無疑是高冷的女神，在追逐的過程總是分分鐘虐得體無完膚，糟心的實驗結(jié)果更是分分鐘想去“狗帶"。征服 CHIP 的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。慶幸的是，曾得到女神青睞的前輩們積累了不少經(jīng)驗。好的經(jīng)驗要分享，特地總結(jié)了各位高手們做 CHIP 的經(jīng)驗，在此奉上，希望能助大家一臂之力。

染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，CHIP）是目前研究體內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的*方法，能夠比較真實的反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 TF 與啟動子 Promoter 的結(jié)合情況。其基本原理：在活細(xì)胞狀態(tài)下，把胞內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)成復(fù)合物，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的小片段，然后利用抗原抗體特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白結(jié)合的 DNA 沉淀下來，特異性富集目的蛋白結(jié)合 DNA 片段，進(jìn)而對目的片斷進(jìn)行純化與檢測（如 qPCR、基因芯片、測序等），從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。

CHIP 主要分為兩種：交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（Cross-linkedChip，XChip）和自然染色質(zhì)免疫沉淀（Native Chromatin Immunoprecipitation, NChip）。兩者的區(qū)別在于 XCHIP 需要甲醛固定，適合于結(jié)合力較弱的 DNA-蛋白質(zhì)相互作用的研究；而 NCHIP 則不需要甲醛固定，不需要交聯(lián)反應(yīng)，主要用于組蛋白修飾（如組蛋白 H3 和 H4，它們本身與 DNA 結(jié)合非常緊密）、核小體定位的研究。在 NCHIP 中，DNA 結(jié)合蛋白與 DNA 之間保持一種自然狀態(tài)，需要采用微球菌核酸酶對染色質(zhì)進(jìn)行消化。 一般而言，我們所提的染色質(zhì)免疫共沉淀指的是 XCHIP。那么長話短說，將 XCHIP 三天實驗中的常見流程及注意事項分享給大家。 

第一天 

細(xì)胞的甲醛交聯(lián) 

1）收集細(xì)胞，加入甲醛（終濃度為 1%），37℃孵育 10min 后，加入甘氨酸（終濃度為 0.125M），混勻后在室溫下放置 5min 即可。 

2）離心棄上清，收細(xì)胞于 15ml 離心管中，用 3ml 預(yù)冷的 1×PBS 洗兩次后，預(yù)冷后 2000rpm  5min 收集細(xì)胞。 

3）棄上清，按照細(xì)胞量，加入 SDS Lysis Buffer，使細(xì)胞濃度為 1×106 個/100 ul。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。

Tip: 

1、細(xì)胞生長狀態(tài)要好，因其生長狀態(tài)直接影響細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能會影響你所研究的 TF 與 Promoter 的結(jié)合。因而，一般細(xì)胞長到 75%-80%比較好。

2、交聯(lián)程度會影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段，背景色加深；交聯(lián)不充分，則只有一部分靶蛋白與 Promoter 結(jié)合，富集得到的 Promoter 的量不高，產(chǎn)生實驗假陰性。建議樣品交聯(lián)的時間為 2-30min。 

3、用 SDS 重懸細(xì)胞時，要選用小的 tip 頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，會對后續(xù)超聲破碎帶來不便。

超聲破碎 

1）冰上孵育 10min 后，利用超聲波或微球菌酶將染色質(zhì)隨機(jī)切為 200~1000bp 的小片段。 14000rpm 離心 10min（4℃），轉(zhuǎn)移上清于 1.5ml EP 管中。 

2）取出 100ul 超聲破碎產(chǎn)物，加入 4ul 5M NaCl（終濃度為 0.2M），65℃處理 4h 進(jìn)行解交聯(lián)，電泳檢測超聲破碎的效果。 

3）另取出 100ul 超聲破碎產(chǎn)物，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50× PIC，再加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，去除非特異性。4℃顛轉(zhuǎn)混勻 1h 后，1000rpm 離心 3min，收集上清。

Tip: 

1、不同細(xì)胞系需不同的超聲時間才能達(dá)到*效果，則可通過時間梯度的超聲來選擇*超聲條件。

2、每份超聲樣品取 50ul，標(biāo)記為 input，用于定量 DNA 濃度（稀釋 200 倍，測 OD260）和作為 PCR 空白對照。同時超聲后樣品應(yīng)立刻存于-70℃中，避免多次反復(fù)凍融。 

3、加入 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 之前一定要混勻，因為 Salmon sperm DNA 是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面 beads 量不一樣，對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

第二天 

免疫共沉淀

1）一管加入 1ul 抗體，另一管中則不加抗體作為對照。4℃顛轉(zhuǎn)過夜。 

2）孵育過夜后，每管加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，沉淀抗體/抗原復(fù)合物， 4℃顛轉(zhuǎn) 1h。1000rpm 4℃ 3min 收集沉淀，棄上清。 

Tip: 

1、每個樣品都采用 25ug 的 DNA 量，同時抗體的量為 1-10ug 的抗體/25ulDNA。 

2、單抗與多抗的選擇也需慎重考慮。單抗特異性強(qiáng)，背景低，但是識別位點單一，在 CHIP 甲醛交聯(lián)過程中，很有可能該位點被其他蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有此問題，但是特異性差，背景可能會偏高。一般建議選擇多抗；選擇單抗時要注意其識別位點需遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域。

純化 DNA 片段 

1）依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗過程：加入溶液 1ml，在 4℃旋轉(zhuǎn) 5min，1000rpm  3min，去除上清。 

洗滌液： 低鹽免疫復(fù)合物洗脫液，洗一次；高鹽免疫復(fù)合物洗脫液，洗一次；氯化鋰免疫復(fù)合物洗脫液，洗一次； TE Buffer，洗兩次。

2）清洗完畢后，進(jìn)行洗脫。每管加入 250ul 洗脫液，室溫下顛轉(zhuǎn) 15min，1000rpm 3min，收集上清液。最終的洗脫液為每管 500ul。

洗脫液： 100ul 10% SDS，100ul 1M NaHCO3 ，800ul ddH2O ，共 1ml。 

3）解交聯(lián)：每管加入 20ul 5M NaCl（終濃度為 0.2M），混勻后，65℃解交聯(lián)過夜。

Tip: 

1、洗滌時，前幾個步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個要盡量吸取干凈，必要時可用 gel  loading tips 吸取上清液。 

2、含 beads 的樣品離心時，轉(zhuǎn)速不能太快，防止 beads 破碎，但如果采用的是磁性的 beads 就不存在這個問題。 

3、解交聯(lián)時，建議在離心前，先把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來。

第三天 

DNA 樣品的回收 

1）每管加入 1ul RNaseA（MBI），37℃孵育 1h。 

2）每管加入 10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（pH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45℃處理 2h。

3）DNA 片段回收—OMEGA 膠回收試劑盒，最終的樣品溶于 100ul ddH2O

Tip: 

1、樣品中 SDS 含量較高時，普通 PCR 回收試劑盒進(jìn)行 DNA 片段回收時，在過柱前，可在樣品中加入一定量的異丙醇，這樣可有效消除 SDS 沉淀。 

2 、一個 CHIP 一般需要 3~4 天時間，其中有幾個步驟是可以停下來的： 

（1）細(xì)胞收集：用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心，去上清的細(xì)胞收集液可置-80℃凍存； 

（2）用 SDS 重懸細(xì)胞后可置-80℃凍存； 

（3）超聲破碎結(jié)束時，離心后的上清置新的離心管后可置-80℃凍存；

（4）解交聯(lián)后的標(biāo)本可置-80℃凍存

DNA 樣品分析 

如果目的蛋白的靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，可選用定量或者半定量 PCR 方法。如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，則可采用 CHIP 克隆測序（CHIP-seq）、CHIP-chip 等方法。

PCR 分析 

目前檢測方法主要有 3 種： 

CHIP-qPCR：用于比較沉淀的模板與陰性和陽性對照信號強(qiáng)度的相對精確的定量 PCR 方法。成本較低。此外，還有一些由 ChIP 衍生出來的方法，如 RIP（即用 ChIP 的方法研究細(xì)胞內(nèi) 蛋白與 RNA 相互結(jié)合，具體方法和 ChIP 差不多，只是實驗過程中要注意防止 RNase，最后 分析時需先將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA）

Tip : 

1、1~10ul 的移液槍取 3ul 以上才比較準(zhǔn)確，要考慮好自己 PCR 反應(yīng)體系的配置。 

2、每次 qPCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準(zhǔn)確。 

CHIP-chip：Chip 和 DNA 微陣列芯片技術(shù)結(jié)合是種高通量分析 DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合或翻譯后染 色質(zhì)和組蛋白修飾的方法。即將經(jīng)過染色質(zhì)免疫共沉淀的 DNA 樣品純化后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 然后用熒光素標(biāo)記（如 Cy3）。對沒有經(jīng)過免疫沉淀反應(yīng)富集的 Input DNA 樣品也進(jìn)行擴(kuò)增， 并且用另一種熒光素標(biāo)記（如 Cy5），作為結(jié)合背景的參照。之后將這兩種 DNA 雜交于包括 基因組序列的微陣列芯片上，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶序列用每個點相應(yīng)的熒光強(qiáng)度來確定。

CHIP-seq：在測序深度和范圍足夠的情況下,ChIP-seq 可以檢測到所有的組蛋白修飾所對應(yīng)的 DNA 結(jié)合位點。ChIP-seq 首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)特異地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段,并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建,然后以 NGS 技術(shù)對富集到的 DNA 片段進(jìn)行高通量測序。 

（NGS 技術(shù)主要是利用 DNA 新模板的合成或連接過程, 用高效平行的方式同時對 DNA 模板 進(jìn)行測序, 從而獲得大量的測序數(shù)據(jù), 即所謂的大規(guī)模平行測序。）