qPCR實(shí)驗(yàn)為什么要制作熔解曲線？

熒光DNA結(jié)合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈，包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號(hào)。

這種噪聲會(huì)影響我們對(duì)靶基因產(chǎn)量的評(píng)估，甚至熒光強(qiáng)度和靶基因的起始量、全長(zhǎng)根本沒什么關(guān)系。

因此，我們使用熒光DNA染料結(jié)合法時(shí)，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線的分析。通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物逐漸升溫，同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來制作熔解曲線。

熔解曲線的縱坐標(biāo)是熒光信號(hào)值，橫坐標(biāo)是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號(hào)峰和對(duì)應(yīng)溫度，可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。

理想情況下，熔解曲線應(yīng)該是單峰，峰值對(duì)應(yīng)溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度，這才能說明擴(kuò)增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。熒光DNA結(jié)合染料法的缺點(diǎn)是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有DNA雙鏈，包括在實(shí)時(shí)熒光PCR中產(chǎn)生的引物二聚體，和其他非特異性產(chǎn)物，引起大量的背景噪聲信號(hào)。

這種噪聲會(huì)影響我們對(duì)靶基因產(chǎn)量的評(píng)估，甚至熒光強(qiáng)度和靶基因的起始量、全長(zhǎng)根本沒什么關(guān)系。

因此，我們使用熒光DNA染料結(jié)合法時(shí)，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線的分析。通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物逐漸升溫，同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來制作熔解曲線。

熔解曲線的縱坐標(biāo)是熒光信號(hào)值，橫坐標(biāo)是溫度值。通過觀察產(chǎn)生的信號(hào)峰和對(duì)應(yīng)溫度，可以判斷產(chǎn)物狀態(tài)。

理想情況下，熔解曲線應(yīng)該是單峰，峰值對(duì)應(yīng)溫度是特異性產(chǎn)物的退火溫度，這才能說明擴(kuò)增產(chǎn)物中特異性產(chǎn)物占比大。