實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化（三）

本期介紹設(shè)計(jì)引物，得到實(shí)時(shí)熒光PCR引物對，這種方法也可以用于普通PCR。

1、長度應(yīng)該在18～30bp，保證結(jié)合的特異性。

2、熔解溫度（Tm值）應(yīng)在55～60°C，兩條引物的Tm值應(yīng)相差2～3°C。

3、每條引物3'端應(yīng)該有1～3個(gè)鳥嘌呤或胞嘧啶，這樣做可以減少PCR過程中的非特異性擴(kuò)增。超過3個(gè)時(shí)會(huì)起反作用，發(fā)生“滑動(dòng)效應(yīng)"導(dǎo)致錯(cuò)誤延伸。

4、引物的GC含量應(yīng)該在50%左右，過高的GC含量會(huì)升高Tm值。

5、引物中應(yīng)該避免反向重復(fù)序列，因?yàn)檫@會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響引物結(jié)合在模板上。

6、如果是RT-PCR，還需要避免設(shè)計(jì)引物結(jié)合在外顯子序列上，會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽性。正確做法應(yīng)設(shè)計(jì)在長內(nèi)含子側(cè)翼、或短內(nèi)含子上，又或者是跨越外顯子-外顯子交界區(qū)。

7、對引物進(jìn)行脫鹽純化。

需要注意的是，有時(shí)候當(dāng)你做到了所有要點(diǎn)，引物還是有可能無法擴(kuò)增，這時(shí)候就要重新設(shè)計(jì)引物啦。