實時熒光定量PCR的優(yōu)化（六）

引物和探針的濃度也需要尋找*濃度，這通常憑借經(jīng)驗決定。

為什么要尋找*濃度呢？

因為像Taqman探針在反應(yīng)過程中會被破壞，需要在起始濃度便保留足量的探針。這個濃度通常是在反應(yīng)體系中達到250nmol/L。但我們不能無限制的添加探針，這會增加成本，尤其是大批量檢測時，我們需要減少生產(chǎn)試劑的成本。

實際探索優(yōu)化中，對Taqman探針法為原理的實時熒光定量PCR實驗，我們也可以使用SYBR Green I法對引物濃度進行測試，因為SYBR  Green I染料能與任意雙鏈DNA結(jié)合，可以檢測到產(chǎn)生的引物二聚體和其他非特異性擴增產(chǎn)物的量。引物二聚體會降低擴增效率和特異性，我們希望找到合適的引物濃度，減少二聚體、非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。

綜上，我們需要尋找引物和探針的*濃度，保證反應(yīng)的靈敏度的同時，降低成本，并獲得最大特異性。

在實踐中，我們通常推薦這樣的方法來進行優(yōu)化：

1、優(yōu)化引物濃度時從一個標(biāo)準(zhǔn)的濃度開始優(yōu)化，每次調(diào)整濃度后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，通過分析標(biāo)準(zhǔn)曲線圖判斷優(yōu)化效果。推薦的標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化濃度：Taqman探針法終濃度是500nmol/L，SYBR Green I法是200～400nmol/L。

2、引物濃度效果評判的標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的，且效率>80%，可以認為濃度是合適的，就不需要進一步優(yōu)化了。