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    NGS建庫(kù)人都在用的文庫(kù)質(zhì)量評(píng)定方法，你都知道嗎？

    發(fā)布時(shí)間： 2021-10-25　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2561次

    高通量測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）近年來(lái)飛速發(fā)展，在各個(gè)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。而文庫(kù)的制備是NGS技術(shù)中極為重要的步驟。所謂文庫(kù)制備（Library Preparation）就是在DNA的片段兩端連接上特定序列的接頭的過(guò)程，讓文庫(kù)可以在高通量測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。


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    文庫(kù)構(gòu)建的最終目的在于成功測(cè)序，并獲得序列信息。那么如何判定這個(gè)文庫(kù)能否上機(jī)測(cè)序呢？想必這是大家一致關(guān)注的問(wèn)題。


    文庫(kù)的數(shù)量和質(zhì)量是能否成功測(cè)序的關(guān)鍵。文庫(kù)的濃度和文庫(kù)分布是評(píng)價(jià)文庫(kù)質(zhì)量的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。



    文庫(kù)濃度測(cè)定


    文庫(kù)構(gòu)建完成后，我們首*行文庫(kù)濃度的測(cè)定。核酸定量的方式有多種，但基于紫外分光光度的測(cè)定方法相對(duì)不夠精準(zhǔn)定量，比如Nanodrop或酶標(biāo)儀，我們推薦使用染料法進(jìn)行核酸定量，在文庫(kù)構(gòu)建中比較常用的核酸定量?jī)x器是Thermo Life Qubit 3.0熒光定量?jī)x。

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    文庫(kù)分布檢測(cè)

    如果文庫(kù)濃度符合上機(jī)需求，接下來(lái)我們用Agilent 2100生物分析儀來(lái)檢測(cè)其片段大小是否符合預(yù)期，其峰值大小應(yīng)該是目的片段加上接頭序列的總長(zhǎng)度。

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    除ATAC、cfDNA和small RNA等特殊文庫(kù)外，一般情況下，好的文庫(kù)應(yīng)該呈現(xiàn)出單一的、圓滑的峰且接近正態(tài)分布，并且文庫(kù)中小于280 bp和大于1000 bp的片段占比不要過(guò)大（如大于20%）都可上機(jī)測(cè)序。

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    圖1：常規(guī)文庫(kù)2100峰型圖

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    圖2：cfDNA文庫(kù)2100峰型圖

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    圖3：ATAC文庫(kù)2100峰型圖


    常見(jiàn)問(wèn)題和解決方案


    Q1
     文庫(kù)峰型偏大
    A1

    這種情況出現(xiàn)可能因一輪分選方案中磁珠用量過(guò)少，導(dǎo)致大片段殘留過(guò)多。為保證文庫(kù)主峰在合格上機(jī)范圍內(nèi)，可增加分選方案中一輪磁珠用量來(lái)解決。

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    圖4：文庫(kù)峰型偏大


    Q2
     在150 bp以下出現(xiàn)雜峰
    A2

    這種情況可能是因?yàn)橐锒垠w或者接頭二聚體的出現(xiàn)所致，一般引物二聚體的長(zhǎng)度在100 bp以下，接頭二聚體的長(zhǎng)度在125 bp左右。為保證測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，可以通過(guò)減少引物使用量、連接反應(yīng)前稀釋接頭，降低磁珠的比例對(duì)文庫(kù)進(jìn)行再一次純化來(lái)解決。

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    圖5：接頭、引物殘留峰型圖

    （紅色箭頭標(biāo)注為引物殘留，藍(lán)色箭頭標(biāo)注為接頭殘留）


    Q3
     upper marker出現(xiàn)翹尾
    A3

    高產(chǎn)量文庫(kù)通常會(huì)出現(xiàn)不同程度的過(guò)度擴(kuò)增現(xiàn)象。因?yàn)樵谖膸?kù)擴(kuò)增后期，通常引物被最先耗盡，大量文庫(kù)片段在無(wú)法結(jié)合到引物的情況下，片段之間通過(guò)不*匹配關(guān)系退火結(jié)合，從而形成部分雙鏈+部分單鏈的雜合鏈，且片段更大。根據(jù)不同檢測(cè)方式的對(duì)應(yīng)原理，過(guò)度擴(kuò)增產(chǎn)物在Agilent 2100 生物分析儀峰型中表現(xiàn)為upper marker之后有輕微翹尾；但以上現(xiàn)象均屬正常，不影響文庫(kù)測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

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    圖9：過(guò)度擴(kuò)增峰型圖

    通過(guò)以上介紹，小伙伴們是不是對(duì)文庫(kù)質(zhì)量評(píng)定一目了然了呢？那就趕緊動(dòng)手吧！



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