成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)血管生成模型實(shí)驗(yàn)

一、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和肝素誘導(dǎo)基底膜蛋白提取物內(nèi)的血管生成模型

1.  Matrigel 為一種基底膜提取物，主要由粘連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素。蛋白多糖和 nidogen/entactin 構(gòu)成，經(jīng)濾膜，制備成無菌液體。

2.  肝素溶解于無菌的PBS（pH7.4）中，濃度為16 000單位/ml，酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（aFGF）經(jīng)預(yù)先配備的無菌牛血清清蛋白/PBS溶液稀釋為0.25 ug/ml。

3.  于4℃把各種濃度的肝素或FGF與0.5~1.0ml 的 matrigel 混合，前者體積不超過后者的1%。

4.  把含有0~100 ng/ml aFGFHE 0~64 ug/ml 肝素的0.5 ml matrigel 用21號(hào)針注射到C57小鼠腹白線皮下。

5.  注射后matrigel 在皮下迅速形成單一的固體膠，10天后乙（酉迷）麻醉小鼠，沿腹白線剪開皮膚，剝離出膠塊。

6.  一部分應(yīng)用Drabkin’方法進(jìn)行血紅蛋白測(cè)定，另一部分經(jīng)過10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、染色。

7.  于光鏡下進(jìn)行組織學(xué)檢查，記錄血管形成的數(shù)量。

8.  近年來，還有圓盤狀血管生成系統(tǒng)、大鼠海綿血管生成模型等用于抗血管生成藥物體內(nèi)試驗(yàn)。

二、內(nèi)皮細(xì)胞粘附分析

1.  把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液洗三次，收集并重新懸浮含有0.1%BSA的無血清培養(yǎng)液中，濃度為5×105細(xì)胞/ml。

2.  也可預(yù)先將細(xì)胞與無血清培養(yǎng)液稀釋的不同濃度抑制劑在室溫下，孵育60 min。

3.  將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板內(nèi)（10 ul/孔），與37℃孵育30~90 min。

4.  用Dulbecco‘PBS液清洗細(xì)胞4 次，除去未粘附細(xì)胞，粘附細(xì)胞用20%甲醇稀釋的0.5%結(jié)晶紫染色、固定、漂洗和空氣晾干。

5.  用比例為1：1的乙醇和0.1 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉溶液洗滌染色細(xì)胞，用酶標(biāo)儀在540 nm 測(cè)定吸收度（OD）。