關于細胞轉染實驗，這幾點必須要清楚

細胞轉染是指將外源分子如 DNA RNA 等導入真核細胞的技術。可分為瞬時轉染，穩(wěn)定轉染等

    瞬時轉染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù)，產生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其他調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒 DNA 轉染效率較高，在轉染后 24-72 h 內分析結果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

    穩(wěn)定轉染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小，通常需要一些選擇性標記反復篩選得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。

主要有下面幾種方法：

化學法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質體法；物理法：電穿孔法、顯微注射法、biolistic 顆粒傳遞法；病毒介導法：逆轉錄病毒、腺病毒

A. 陽離子脂質體法：

    帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。過程如下圖：

   特點：

    簡單通用，適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需除血清，轉染效率隨細胞類型變化大。由于脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞，所以貼壁比懸浮轉染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。

B. 電穿孔法：

    利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進入的微孔。

C. 逆轉錄病毒（RNA）：

    通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞，之后反轉錄酶啟動合成 DNA 并隨機整合到宿主基因組中。

    特點：穩(wěn)定轉染，可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等，但攜帶基因不能太大。

D. 腺病毒（雙鏈 DNA）：

    先和細胞表面的受體結合，繼而在αV 整合素介導下被細胞內吞。

    特點：可用于難轉染的細胞。

    影響轉染的因素：

    血清 血清影響復合物的形成，降低轉染效率

    陽離子脂質體和 DNA 的最佳量在使用血清時會有所不同，因此想在轉染培養(yǎng)基中加入血清時要進行條件優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內保持健康，對于對血清缺乏比較敏感的細胞，可以使用 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用 LIPOFECTAMINE 2000。

    抗生素

    比如青霉素和鏈霉素，是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率低。

    細胞代數(shù)

    轉染前細胞最好經過 1-2 次傳代保證細胞生長旺盛容易轉染，注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉染。

    細胞鋪板密度

    一般轉染時，貼壁細胞密度為 70%-90%，懸浮細胞密度為 2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。

    DNA 質量

    DNA 質量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術基于電荷吸引原理，如果 DNA 不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成和轉染的進行。

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