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    大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細胞培養(yǎng)實驗——牛血清培養(yǎng)法

    發(fā)布時間： 2021-12-06　　點擊次數(shù)： 1081次

    材料與儀器

    Wistar大鼠
    亞（石西）酸鈉 腐胺 轉(zhuǎn)鐵蛋白 胰島素 甲狀腺素 黃體酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗體
    眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

    步驟

    一、實驗步驟

    1.  取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，無菌條件下取出雙側(cè)視神經(jīng)。
     
    2.  接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。
     
    3.  加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，37℃，50mL/L CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3 d 。
     
    4.  3 d 后棄廢液，改為含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
     
    5.  每周換液2次。在獲得足夠的細胞數(shù)量后，改用無血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換液一次。

    二、形態(tài)學(xué)觀察

    每天在倒置顯微鏡，觀察培養(yǎng)細胞的生長過程和形態(tài)學(xué)變化并拍照。

    三、免疫細胞化學(xué)鑒定

    1.  將含細胞蓋玻片取出，0.01 mol·L-1 PBS沖洗3 次x5 min。

    2.  冷丙酮固定10 min。

    3.  PBS沖洗(3 次x5 min)。

    4.  30g·L-1 過氧化氫室溫孵育15 min。

    5.  PBS沖洗3 次x5 min。

    6.  滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。

    7.  滴加1:100 GC抗體，陰性對照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。

    8.  PBS沖洗3 次x5 min。

    9.  滴加 生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃，20 min。

    10.  PBS沖洗3 次x5 min。

    11.  滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。

    12.  DAB工作 液顯色，自來水終止反應(yīng)。

    13.  脫水，透明，DPX封片保存。

    四、結(jié)果

    1. 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

    組織塊24 h 開始貼壁，48～72 h 可見神經(jīng)組織邊緣游出少量細胞，主要為圓形或梭形(圖 1)。8～9 d 左右，細胞基本鋪滿培養(yǎng)孔。此時改用無血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)進行純化。培養(yǎng)過程中，部分細胞死亡。12 d 左右獲得的細胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約 6～10μm。細胞核較大，胞質(zhì)少(圖 2)。

    2. 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

    培養(yǎng)的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細胞的免疫組織化學(xué)染色 GC 蛋白陽性，未加一抗的呈陰性。染色結(jié)果顯示成熟的少突膠質(zhì)細胞突起豐富，互相形成蜘蛛網(wǎng)狀(圖 3)。蘇木素復(fù)染，異質(zhì)細胞較少，90%以上為陽性細胞(圖 4)。
     

    Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10)
    圖 1. 培養(yǎng)第 3 天，細胞自視神經(jīng)遷出 (10x10)


    Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40)
    圖 2. 培養(yǎng)第 15 天，純化的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細胞(10x40)


    Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20)
    圖 3. 培養(yǎng)第 7 天，少突膠質(zhì)細胞 GC 陽性表達 (10x20)



    Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20)
    圖 4. 培養(yǎng)第 15 天，純化的少突膠質(zhì)細胞 GC 陽性表達(蘇木素復(fù)染)(10x20)


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