細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)方法詳解

自噬（autophagy）被認(rèn)為是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過程，也是對(duì)等壓力源的反應(yīng)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏，這可能會(huì)危及細(xì)胞的生存。當(dāng)細(xì)胞接觸到這些壓力源時(shí)，原本在低水平發(fā)生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就會(huì)被大幅度上調(diào)。這種上調(diào)會(huì)增加了細(xì)胞的吸收和降解，將大分子釋放回胞質(zhì)中以驅(qū)動(dòng)必須的代謝反應(yīng)并產(chǎn)生能量。

在正常和壓力條件下，自噬對(duì)細(xì)胞健康的貢獻(xiàn)，意味著這種嚴(yán)格調(diào)控和精確協(xié)調(diào)過程的重要生理和病理作用。事實(shí)上，自噬在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)是有用的。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬是各種疾病和病癥的重要調(diào)節(jié)器。探索自噬在發(fā)育和疾病中的參與，對(duì)于更全面地了解這一途徑的作用至關(guān)重要，并且可能對(duì)保持健康或治療疾病有影響。

自噬的研究已經(jīng)成為如今醫(yī)學(xué)研究的?？?，發(fā)文量也十分巨大，成為常規(guī)生物學(xué)現(xiàn)象來研究，但是有一些實(shí)驗(yàn)上的技巧值得探討一二，例如一些試劑的使用等等

1、自噬相關(guān)試劑的使用。

①M(fèi)DC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其濃度為50 mmol/L,分裝后-20冰箱保存。臨用前用MEM稀釋到終濃度50 umol/L;

②Rapamycin:用MEM培養(yǎng)基配成終濃度為1 umol/L,現(xiàn)用現(xiàn)配;

400ng/ml喹乙醇:稱取4 mg喹乙醇,DMSO預(yù)溶(體積<0.1%)后加入10 ml MEM培養(yǎng)液至*溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存;

③3-MA:首先用PBS溶解粉末,臨用前加熱至*溶解后再加入MEM培養(yǎng)基至終濃度10mmol/L;PI3K抑制劑（3-MA，Wortmannin）可干擾或阻斷自噬體的形成；

用RAPAMYCIN誘導(dǎo)自噬我也查過一部分文獻(xiàn)，有用無血清的，也有用，一般培養(yǎng)基的，濃度從25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培養(yǎng)基中，目的是排除無血清所誘導(dǎo)出來的自噬。

 文獻(xiàn)說饑餓初期激活的是大分子自噬，在4-6小時(shí)活力達(dá)到最大，24h后以CMA途徑為主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，貨號(hào)E2888，有碳酸氫鈉，有酚紅的，酚紅到不是很必須，只是一個(gè)PH指示作用，好看些

⑤無血清誘導(dǎo)自噬：EBSS 誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)就可以了。

EBSS一定可以誘導(dǎo)出來，只是需要說明的是時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置，因?yàn)閺酿囸I誘導(dǎo)開始半個(gè)小時(shí)就可能開始自噬了，一直到24小時(shí)都持續(xù)，所以應(yīng)該設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)觀察這個(gè)作用。另外一個(gè)很大的問題是，饑餓誘導(dǎo)的一個(gè)很大的弊端是細(xì)胞死亡，這也是我面臨的問題，就是在細(xì)胞收養(yǎng)的時(shí)候蛋白濃度太小了。24小時(shí)就很少了，更不要說48小時(shí)和72小時(shí)了。

⑥Hank's誘導(dǎo)，也就是通常所說的饑餓誘導(dǎo)，細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后以Hank's替代常規(guī)*培養(yǎng)基，3h后就可誘導(dǎo)出自噬。我用Hank's誘導(dǎo)了3h后電鏡觀察有30%細(xì)胞都有自噬這種現(xiàn)象，但不如國(guó)外報(bào)道的高。

⑦sigma的氯喹的貨號(hào)C6628。用氯喹做自噬抑制劑，293T細(xì)胞50uM就可以。1. 可以用雙蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制劑機(jī)制不同。抑制的步驟也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后續(xù)的步驟，Chloroquine抑制自噬體與溶酶體的融合過程，autophgy不能完成，所以lc3才會(huì)累積。因此加了抑制劑lc3之后會(huì)比不加的要高。氯喹能提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶喪失活性，從而導(dǎo)致“自噬溶酶體"不能降解，因此，位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3不能按時(shí)降解，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3熒光長(zhǎng)時(shí)間的保留或WB中LC3條帶變粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制劑）抑制EV71感染所引起的細(xì)胞凋亡，觀察細(xì)胞的自噬情況。研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞凋亡能增加LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II以及p62的降解。

1.   雷帕霉素：作為以mTOR 為靶點(diǎn)較為經(jīng)典的誘導(dǎo)劑已經(jīng)被廣為應(yīng)用，推薦工作濃度為1μmol-10μmol；

 2.   氯喹：氯喹（Chloroquine）作為溶酶體的抑制劑，可以抑制自噬體與溶酶體的融合從而可以用來作為自噬以及自噬流的抑制劑用于實(shí)驗(yàn)研究，推薦使用濃度：10umol-50umol。

2、自噬誘導(dǎo)劑

 正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的藥物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

 (2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

 (3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

 (4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

 (5) Rapamycin：mTOR抑制劑

 (6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

3、自噬抑制劑

 (1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑

 (2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

 (3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):T7765 ;溶于DMSO中配成儲(chǔ)存液,使用時(shí)DMSO終體積濃度不超過1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):M9281;溶于滅菌超純水制成儲(chǔ)存液。

氯喹二磷酸鹽(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):C6628;溶于滅菌超純水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):R8781;

4、MDC染色焚光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自睡

單丹黃酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一種突光染料,被用作自吞泡的示蹤劑。具體操作步驟如下:

(1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞按常規(guī)方法消化后接種于6孔板,每孔接種1x106個(gè)細(xì)胞;

(2)細(xì)胞密度達(dá)到60%-70%時(shí),棄去培養(yǎng)液,小心用PBS洗1遍,分別用含TG濃度為0、0.5、1 nM的培養(yǎng)基及含Rapamycin (終濃度1 pM)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h;

(3)棄上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(終濃度50 nM)的培養(yǎng)基于37 V、5% CCh的恒溫培養(yǎng)箱中避光溫育20 min;

(4)取出六孔板置于勞光顯微鏡下,Ih內(nèi)觀察細(xì)胞自唾發(fā)生情況并拍照。

5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬發(fā)生率

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,接種于6孔板,培養(yǎng)24h之后,分別用含TG濃度為0、1、2、4、8uM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h和0.5uM的TG作用不同時(shí)間(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,將上清收集到4 ml的離心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(終濃度50nM)的MEM培養(yǎng)基,于37°C、5%0?的恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育30 min;

(3)將收集的上清2000rpm,離心5min;

(4)棄掉上清,每管加入500ul含MDC(終濃度50 uM)的MEM培養(yǎng)基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混勻收集到1.5ml的離心管中,2000 rpm.離心5 min;

(6)棄掉上清,加1ml的PBS重懸,2000rpm,離心5 min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;

(8)鮮育完的上清,2000rpm,離心5 min;

(9)棄掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的離心管中,2000 rpm,離心5 min;

(10)重復(fù)步驟(6)和(7);

(11)將上述兩個(gè)相同濃度或相同時(shí)間點(diǎn)的兩管混勾,過300目銅網(wǎng)上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞

儀以488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定MDC染色的熒光強(qiáng)度。

LC3B WB: 1:2000

條件是15% SDS-PAGE, 正常跑膠至下沿0.5cm即可，200mA 濕轉(zhuǎn)45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封閉1h，4C過夜搖動(dòng)孵育，洗抗體3*5min即可

LC3B的Western-blot檢測(cè)，配置的15%的分離膠，濕轉(zhuǎn)250mA，60min

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