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    cDNA 3'末端的快速擴增（3’-RACE)

    發(fā)布時間： 2021-12-21　　點擊次數(shù)： 1290次

    原理

    在用 oligo (dT) 引物構(gòu)建的 cDNA 文庫中，偶而發(fā)生部分 cDNA 克隆缺失了與靶 mRNA 3' 末端互補的序列。這部分序列到底是在 cDNA 合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個環(huán)節(jié)中缺失的尚不清楚。第一鏈 cDNA 的隨機斷裂，在合成第二鏈 cDNA 過程中 DNA 聚合酶不能抵達模板鏈的末端，引導(dǎo)序列內(nèi)部的 poly (A) 序列或在分子克隆過程中 poly (dA:dT) 序列附近的 3' 序列的缺失等都是可能造成 3' 末端序列缺失的原因。在用隨機六核苷酸引物構(gòu)建的 cDNA 基因文庫中，也存在部分的 cDNA 克隆缺失了 3' 末端序列，這是因為這種隨機引物能與靶 mRNA 的許多位點復(fù)性結(jié)合所致。

    材料與儀器

    反轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶 接頭引物 基因特異性反義寡核苷酸引物 總 RNA
    擴增緩沖液 氯仿 dNTP 貯存液 胎盤 RNase 抑制劑 TE
    瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 屏蔽型槍頭 微量離心管 正向排液式移液器 PCR 儀 水浴箱

    步驟

    一、材料

    1. 緩沖液與溶液

    10X 擴增緩沖液

    氯仿

    4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

    胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/μl）

    TE ( pH 7.6)

    2. 酶與緩沖液

    反轉(zhuǎn)錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶）

    5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液

    熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶

    3. 凝膠

    瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

    4. 核苷酸與寡核苷酸

    接頭引物（10 μmol/L, 5' GACTCGAGTCGACATCG3' ) 溶于水中（10 pmol/μl）

    （接頭引物可以與基因特異性正向引物聯(lián)合在一起用于擴增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴增后，PCR 目的產(chǎn)物可能僅占總 DNA 產(chǎn)物的 1%，也可能多至占總 DNA 產(chǎn)物的 100%。如果必要，可用第一輪 PCR 產(chǎn)物作模板進行第二輪嵌套式 PCR，改善目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴增后，幾乎所有的擴增產(chǎn)物在 EB 染色下呈現(xiàn)了靶 mRNA 的 5' 區(qū)域序列相一致的條帶。

    RT-PCR 的引物用自動 DNA 合成儀合成，用于標(biāo)準(zhǔn) RT-PCR的引物一般不需要進一步純化。然而，如果寡核苷酸引物經(jīng)商品化的樹脂進行柱層析純化（如 NENLife- Science 公司產(chǎn)品 NENSORB)或者經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，純化后的引物用于擴增低豐度的 mRNA 時常常會更有效。）

    （dT)17-接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173'）溶于水中（10 pmol/μl)

    基因特異性反義寡核苷酸引物（10 μmol/L) 溶于水（10 pmol/μl）。

    （基因特異性反義寡核苷酸引物應(yīng)該與靶 mRNA 的已知序列互補，其長度在 20~ 30 bp，內(nèi)含的 4 種堿基數(shù)量基本相等，G 與 C堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發(fā)形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的傾向。）

    總 RNA（100 μg/ml）或 poly (A)+ RNA（10 μg/ml）溶于水中

    （總 RNA一般用離液劑（chaotropic agents) 從細(xì)胞中抽提的，選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過 RT-PCR 克隆靶基因。對于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進行 RT-PCR。運用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養(yǎng)細(xì)胞中制備。）

    5. 特殊設(shè)備

    自動微量移液器的屏蔽型槍頭

    微量離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應(yīng)專用離心管）或微量滴定板

    正向排液式移液器

    PCR 儀

    水浴箱預(yù)設(shè)水溫在 75℃

    二、方法

    反轉(zhuǎn)錄

    在實驗開始時，首先要確定 3'-RACE 是否成功。如果反轉(zhuǎn)錄步驟是有效的，那么分離到含有靶 mRNA 的 3' 末端序列的克隆的幾率是高的。另一方面，如果反轉(zhuǎn)錄步驟是無效的，那么本方案的后續(xù)步驟是無法彌補的。因此，對于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件是值得花時間優(yōu)化的，如最佳的引物與模板比例，改變反應(yīng)體系 Mg2+ 濃度，尋找最適的 Mg2+ 濃度。

    1. 轉(zhuǎn)染 1 pg 至 100 ng 的 poly （A）+ RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調(diào)整體積至 10 μl。將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min，將離心管迅速插入冰中冷卻。

    2. 向含有這種變性的 RNA 樣品的離心管內(nèi)依次加入如下試劑：

    5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液                              10 μl

    20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液               1.5 μl

    10 μmol/L (dT)17-接頭引物（80 pmol）  8 μl

    約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑          1 μl

    100~200 單位/μl 反轉(zhuǎn)錄酶                    1 μl

    H2O 補足至                                         50 μl

    反應(yīng)管溫育在 37℃ 反應(yīng) 60 min。設(shè)置 3 支陰性對照管。在一支對照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應(yīng)所需的所有試劑，但不加模板 RNA；第二支對照管加入除了反轉(zhuǎn)錄酶外的所有試劑；第三支對照管中加入除引物外的所有試劑。這些對照管進行所有的后續(xù)步驟。設(shè)置這些對照管能保證 cDNA 產(chǎn)物的不是由于污染或由 RNA 的自身引導(dǎo)所致。

    3. 用 TE ( pH 7.6 ) 將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物（cDNA ) 稀釋至終體積為 1 ml。

    擴增

    4. 按以下次序，將各成分加入到一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板的孔內(nèi)，建立 PCR 系列反應(yīng)管：

    已稀釋 cDNA                                                             0~20 μl

    10X 擴增緩沖液                                                          5 μl

    20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液                                      5 μl

    10 μmol/L (dT)17-接頭引物（16 pmol）                        1.6 μl

    10 μmol/L 接頭引物（32 pmol）                                  3.2 μl

    10 μmol/L 基因特異性正義寡聚核苷酸引物（32 pmol）  3.2 μl

    1~2 單位熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶                                       1 μl

    H2O 補足至                                                                50 μl

    如果實驗必要，可建立系列的擴增試驗管，用于篩選 cDNA 產(chǎn)生最大量的 3' 末端擴增產(chǎn)物的試驗管。對照管加入以上除了 cDNA 模板之外的所有試劑，以鑒別模板有無污染。

    5. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油（約 50 μl），防止樣品在 PCR 反應(yīng)多個加熱與冷卻的循環(huán)過程中蒸發(fā)；如果應(yīng)用熱啟動 PCR 程序， 在反應(yīng)混合液上層加一滴石蠟油；放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。擴增核苷酸的典型程序有變性、復(fù)性和聚合（延伸反應(yīng)）；相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下：

    6. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結(jié)果，用判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴增的量與片段大小。

    7. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層，反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

    8. 從擴增的 DNA 產(chǎn)物中分離掉殘余的熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶和 dNTP。

    以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。


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