細(xì)胞毒性分析

原理

以CCK-8法為例簡述其原理：CCK-8試劑盒中含水溶性四唑鹽WST-8 (化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下，活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黃色甲瓚燃料，而甲臜染料的生成量與活細(xì)胞的數(shù)量成線性關(guān)系。

用途

1、藥物篩選實驗；
2、腫瘤藥敏試驗；
3、生物活性因子的活性檢測；
4、細(xì)胞增殖測定等；

材料與儀器

【材料】細(xì)胞懸液，化合物溶液、CCK8試劑、*培養(yǎng)基、PBS、0.25%Trypsin-EDTA

【儀器，耗材】96孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱，檢測波長450-490nm酶標(biāo)儀

步驟

1、根據(jù)具體細(xì)胞類型確定其在 96 孔板種植密度，以對照組細(xì)胞密度至檢測時達(dá)到 70%-90%為參照，每組設(shè)置 3-6 個復(fù)孔，孔板邊緣空不用，加入與培養(yǎng)基等體積的無菌 PBS 溶液；

2. 每孔加入培養(yǎng)基體積 1/10的CCK-8 溶液。若起始的培養(yǎng)體積為 200 微升，則需加入 20 微升 CCK-8 溶液，其它情況以此類推。同時以加了相同體積細(xì)胞培養(yǎng)液和 CCK-8 溶液但沒有細(xì)胞的孔作為空白對照。若所用藥物會干擾檢測結(jié)果，則選加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但無細(xì)胞的孔作為空白對照（注意不可產(chǎn)生氣泡）；

3. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 2-4 小時，建議選取2、3、4小時后分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗；

4. 在 450 nm測定吸光度。如無 450 nm濾光片，可以使用 420-480 nm的濾光片?？梢允褂么笥?600 nm的波長，例如 650 nm，作為參考波長進行雙波長測定。

注意事項

1、本實驗使用96孔板進行檢測，周圍一圈最容易蒸發(fā)，檢測會因體積不準(zhǔn)確而增加誤差故棄用周圍一圈，加入等體積相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；

2、本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，因而還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。

3、用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定；

4、酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去；

5、試劑有一定的毒性，請穿好實驗服并戴一次性手套操作；

6、試劑要注意避光4oC或-20oC保存；

常見問題

1. 如果細(xì)胞生長較慢，且細(xì)胞較小，可以最大接種1x10^4 cells/well，但加入化合物后處理時間最長為72 h。

2. 化合物如果難溶于水，可以在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加DMSO、DMF以助溶，但最大濃度不宜超過0.5%，因為DMSO和DMF對細(xì)胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、DMF助溶，需保證其他濃度的化合物DMSO、DMF的濃度也相同。

3.若吸光度值太低，怎么辦法？
1）適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量；
2）延長加入CCK-8溶液后的孵育時間