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    大鼠肝癌模型法

    發(fā)布時間： 2022-12-02　　點擊次數(shù)： 959次

    原理


    1. Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路。在正常的體細(xì)胞中，β-catenin只是作為一種細(xì)胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin形成復(fù)合體對維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的移動發(fā)揮作用。只有當(dāng)細(xì)胞外Wnt信號分子與細(xì)胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結(jié)合激活胞內(nèi)的d ishevelled（散亂的）蛋白導(dǎo)致GSK3B失活，使α-catenin避免被磷酸化而遭降解的命運 , β-catenin才能在胞質(zhì)中積累起來。


    2. 當(dāng)胞質(zhì)中B-catenin的濃度達(dá)到一定水平時， 就可向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。在胞核中β-caten in與轉(zhuǎn)錄因子家族Tcf /Lefs結(jié)合， 可激活cyc linD1 和cmyc等原癌基因而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化、成熟。顯然， 在這條信號通路中β-catenin 發(fā)揮了重要作用，其在胞質(zhì)中積累繼而向胞核的轉(zhuǎn)位， 被認(rèn)為是該信號通路被激活的標(biāo)志。已有研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在人結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生中被激活。并抑制下游蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括axin、GSK-3、與APC蛋白。axin/GSK-3/APC 復(fù)合體可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號分子β-catenin的降解。當(dāng)“β-catenin 降解復(fù)合物"被抑制后，胞漿內(nèi)的β-catenin得以穩(wěn)定存在，部分 β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族作用并促進(jìn)特定基因的表達(dá)。


    3. 建立大鼠的肝癌模型，以Wnt/β-catenin 信號通路中的幾個關(guān)鍵因子為研究對象， 探討它們在正常鼠肝、不典型增生鼠肝和腫瘤肝臟中的表達(dá)，以期揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肝腫瘤發(fā)生的關(guān)系，為臨床上肝癌的診治提供新的線索。


    材料與儀器

    SD雄性大鼠
    兔抗β- caten in 抗APC 抗體 鼠抗cyclin D1 mAb PV6001兩步法檢測試劑盒 總RNA 提取試劑盒 PCR 反應(yīng)試劑盒
    凝膠成像儀 電泳儀 PCR儀器 槍頭 槍頭盒 移液槍 超凈臺

    步驟

    1.  大鼠肝癌模型的建立


    將二已基亞硝胺（ DENA）的水溶液以70 m g /kg的劑量每周灌胃1次， 15周停藥。有10只大鼠在造模過程中死亡，其余32只分別在喂藥后第1、4、6、8、10、12、14、16周，處死動物，每次處死4 只。每只取不同部位的小塊肝組織，分別置于40 g /L 多聚甲醛固定液中固定并液氮凍存。正常對照組8只，不給藥。


    2.  wnt1、β-catenin、APC、cyc lin D1 及cmyc mRNA 的RT-PCR 檢測


    引物的設(shè)計和合成交由大連寶信生物公司完成，經(jīng)驗證后使用。


    擴(kuò)增wnt1 基因的引物序列為： 5-ATCCTG CAC CTG CGA CTA CAG-3和5-GGC GAC TTC TCG AAGTAG ACC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為432 bp，退火溫度為58e 。擴(kuò)增β-caten in基因的引物序列為： 5-AAG TTC TTG GCT ATTACG ACA-3和5-ACA GCA CCT TCA GCA CTCT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為375 bp, 退火溫度為58. 2e 。


    擴(kuò)增APC 基因的引物序列為： 5-CGG AAC ATG CAT GAC TGA GAC-3 和5-GTC ACGAGG TAC GAC CTC AGAT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為310 bp，退火溫度為60e 。


    擴(kuò)增cy clin D1基因的引物序列為： 5-CAGAAGTGCGAAGCTTAGGTCT-3 和5-GTA GCA GGA GTA GTC CAGCGG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為440 bp， 退火溫度為58e 。


    擴(kuò)增cmyc基因的引物序列為： 5-GGA ACT ATG ACC TCG ACT ACGAC-3和5-ACC ATG TCT CCT ACA GTA GCTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為186 bp，退火溫度為60. 5e 。


    擴(kuò)增內(nèi)參照B-actin引物的序列為5-CGT TGA CAT CCG TAA CGA CTCC-3和5-ATA GAGCCA CCA TTC CGA CAC AG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為665 bp， 退火溫度為60e 。


    注意事項


    1. 采用多聚甲醛來固定大鼠組織時，固定時間避免太久，否則組化盡出假陽性。把固定時間確定下來，固定好后放低濃度酒精里可以放置時間久一點。


    2.  對于取出大鼠小塊肝部位，避免肝的重要部位有鑷子的刮痕，以免對實驗后期的觀察產(chǎn)生影響。             

    3. 實驗需要進(jìn)行對照組對比，以免出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。


    4. 擴(kuò)增基因序列時，要嚴(yán)格按照所設(shè)定的溫度進(jìn)行。


    常見問題


    1. Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關(guān)重要的作用。如果這條信號通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致信號異常活化，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。


    2. 經(jīng)文獻(xiàn)報道，研究人員檢查了超過3500份的癌癥樣本，包括結(jié)腸癌、黑色素瘤、肝細(xì)胞瘤、脊髓母細(xì)胞瘤、消化道腫瘤等，發(fā)現(xiàn)在超過700個癌癥病例中出現(xiàn)β-Catenin的多種突變。Β-Catenin的N端序列可能是其致癌的關(guān)鍵位點，這些位點的突變使得β-Catenin在胞內(nèi)表達(dá)失控，導(dǎo)致Wnt信號異常激活，從而誘發(fā)包括結(jié)直腸癌、肝母細(xì)胞瘤、卵巢癌和前列腺癌等在內(nèi)的多種癌癥。


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