PEG 介導(dǎo)的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合

（一）試劑配制

（1）HAT 選擇培養(yǎng)液 常用兩種儲存液（100xHT 和 100xA）來稀釋配制 HAT 培養(yǎng)液。

① 100xHT 稱取次黃-嘌-呤 136.1 mg 和胸腺嘧啶核苷 38.8 mg，加細胞培養(yǎng)用水至 100 ml。若溶解不佳，加熱（70 ℃）助溶。100 倍儲存液中，次黃-嘌-呤濃度為 10 mmol/L，胸苷為 1.6 mmol/L。0.22 μm 濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

② 100xA 稱取氨基蝶呤 1.76 mg，溶解于細胞培養(yǎng)用水中。加 1.0 mol/L NaOH 0.5 ml 助溶，再用 1 mol/L HC1 將 pH 調(diào)回至中性，定容至 100 ml。注意勿調(diào)成酸性，因為氨基蝶呤對酸敏感。100 倍儲存液中氨基蝶呤的濃度為 0.04 mmol/L。0.22 μm 濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃ 保存，可保存 1 年。

③ 將 100xHT 和 100xA 各按 1:100 比例加到含小牛血清的完-全培養(yǎng)基中，即成 HAT 選擇培養(yǎng)液。其中各成分的最終濃度分別為：H,1x10-4 mol/L;A,4x10-7 mol/L;T,1.6x10-5 mol/L。 

（2）100xHT 培養(yǎng)液 10 mmol/L 次黃-嘌-呤鈉鹽；1.6 mmol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷。

（二）準備脾細胞

（1）處死動物并用乙醇擦拭腹部，剖開腹部暴露脾臟。

（2）用滅菌的鑷子和剪刀取出脾臟，置于一盛有 50 ml 滅菌 PBS 的燒杯中，洗去血污。

（3）把脾臟移入一盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿中。除去所有的多余組織和脂肪，并用 PBS 沖洗脾臟。

（4）把脾臟移入盛有 20 ml 滅菌 PBS 的培養(yǎng)皿，用滅菌的剪刀、鑷子剪碎組織，制成單細胞懸液。

（5）收集細胞于 50 ml 離心管，用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗培養(yǎng)皿并轉(zhuǎn)移入離心管。靜置 1 min。

（6）小心把細胞懸液移入一新的離心管，不要讓管底的組織塊一并轉(zhuǎn)入。

（7）用 10 ml 滅菌的 PBS 清洗有組織塊的離心管，靜置 1 min 后小心移出細胞懸液，并和上一次的細胞懸液混合。

（8）室溫下以 800 g 離心 5 min。

（9）小心棄上清液。用 50 ml 滅菌的 PBS 重懸細胞，重復(fù)離心。

（10）小心棄上清液。在 10 ml 滅菌的 PBS 中重懸細胞。

（11）取 1 滴進行細胞計數(shù)。

（三）準備骨髓瘤細胞

（1）從 2～4 個培養(yǎng)瓶中收集處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞。

（2）用滅菌的 PBS 清洗細胞，800 g 離心 5 min。

（3）重復(fù)洗滌、離心一次。

（4）用 10 ml 滅菌的 PBS 重懸細胞。

（5）取 1 滴進行細胞計數(shù)。

（四）融合步驟

（1）以 3:1～5:1（脾細胞：骨髓瘤細胞）的比例在 50 ml 離心管中混合脾細胞和骨髓瘤細胞（細胞總數(shù)約為 106）。室溫下 800 g 離心 5 min。

（2）盡可能地棄去上清液。輕叩管底使沉淀松動，置 37 ℃（39 ℃ 更佳）水浴中預(yù)溫。

（3）緩慢逐滴加入 1 ml 37 ℃ 預(yù)溫的 50％ PEG 溶液，邊加邊輕搖混勻，加完后用吸管輕輕吹打混勻。37 ℃ 靜置 1 min。

（4）用 20 ml 滅菌的 PBS 稀釋 PEG。注意動作一定要緩慢，尤其是開始稀釋時（最初 1 ml 在 1 min 內(nèi)加完，之后可加快速度）。800 g 離心 5 min，棄上清液。

（5）重復(fù)洗滌、離心一次。

（6）棄上清。在 HAT 培養(yǎng)液中重懸沉淀，使細胞密度為 5x105 個/ml

（7）轉(zhuǎn)入 96 孔培養(yǎng)板，每孔 0.2 ml。在 CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃ 培養(yǎng)

 5～7 d，其間根據(jù)需要換 HAT 培養(yǎng)液。

（8）觀察細胞融合結(jié)果。