如何提高 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏度與特異性

1.首先確定模板 RNA 完整性好，無 DNA 污染。

2.RNA 模板中不應(yīng)含有擴增反應(yīng)抑制劑。

3.為了防止模板降解，在反應(yīng)體系中加入 RNase 抑制劑 RNasin。

4.使用適量的模板 RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導(dǎo)致擴增不出條帶或條帶太弱。

5.若模板中有二級結(jié)構(gòu)，可通過提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來提高擴增效果。

6.設(shè)計引物時，避免在引物 3’端含有互補序列，避免形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

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