原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

原代細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

1. 為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段；
   

2. 為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件；

3. 服務(wù)于臨床實(shí)踐，用于藥物篩選等。

原代細(xì)胞培養(yǎng)之取材

取材作為原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的第一部至關(guān)重要，以下幾種取材技術(shù)，你都用過(guò)哪些方法呢？

各類(lèi)組織取材，操作及注意事項(xiàng)：

1.皮膚和黏膜

  主要取皮片，面積一般2~4平方厘米

2.內(nèi)臟和實(shí)體瘤

1. 無(wú)菌環(huán)境；

2. 熟悉所需組織的類(lèi)型和部位；

3. 要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。

3.血液細(xì)胞

  一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、琳巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝。

4.骨髓、羊水、胸/腹水

  嚴(yán)格無(wú)菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不易低溫存放。

5.動(dòng)物組織取材-鼠胚組織

1. 用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適和動(dòng)物；

2. 將其浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后去除動(dòng)物；

3. 在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開(kāi)皮膚；

4. 用無(wú)菌操作法解剖取胚。

   
   

6.動(dòng)物組織取材-幼鼠胚腎（或肺）

  幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側(cè)，采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺，或從背部打開(kāi)腹腔取腎。

7.雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織

1）取孵化至適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和配體位置；

2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；

經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或鑷子打開(kāi)氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；

3）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；

4）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材；

原代細(xì)胞培養(yǎng)之分離注意事項(xiàng)

1.組織塊培養(yǎng)法

1）組織塊接種后的前3天，在觀察和移動(dòng)的過(guò)程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng)，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。

2）加入的培養(yǎng)液不宜過(guò)多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來(lái)。

3）當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來(lái)后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。

4）為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。

2.貼壁型原代細(xì)胞

1）原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí)，它們之間會(huì)相互影響，在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng)。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)低，細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過(guò)程。如果接種的細(xì)胞密度過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類(lèi)似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用，會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

3）盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

3.懸浮型原代細(xì)胞

1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)皿內(nèi)加入培養(yǎng)液，以5ml為最淺限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。

2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。

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