永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HCMEC/D3）培養(yǎng)指南

簡(jiǎn)介：

 HCMEC/D3細(xì)胞系來自于癲癇患者手術(shù)切除的富含腦內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）的組織，并從中分離出人顳葉微血管。后續(xù)使用人端粒酶（hTERT）和SV40大T抗原的催化亞基通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細(xì)胞依次永生化后，通過有限稀釋克隆法選擇性分離CEC，最終鑒定所得的細(xì)胞，具有廣泛的腦內(nèi)皮細(xì)胞表型特征。可表達(dá)大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞；可在基質(zhì)膠上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)；可作為人血腦屏障（BBB）模型。可用于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞，血管，藥物攝取與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等。

培養(yǎng)條件：

 內(nèi)皮細(xì)胞專用基礎(chǔ)培養(yǎng)基-EMC培養(yǎng)基+5%FBS+1%內(nèi)皮細(xì)胞生長添加物和1%青霉素/鏈霉素溶液。置于37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

消化（10cm皿為例）：

1. 當(dāng)單層培養(yǎng)細(xì)胞匯合達(dá)80%。

2. 棄去舊培養(yǎng)基，2mlPBS潤洗兩次。

3. 用1ml含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min（在培養(yǎng)箱放1min，然后鏡下觀察變圓）。

4. 用1ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，九宮格法吹落細(xì)胞收集到離心管，以800-1000rpm，室溫離心5min。

傳代：

以1:2~1:3的比例傳代，離心棄去廢液，用2ml~3ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞沉淀成單個(gè)細(xì)胞，以“"Z“"字打入含有7ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中，輕柔十字晃勻不超過十下并靜置數(shù)分鐘后鏡下觀察，平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱中。

凍存：

1. 凍存液的配置為血清：二甲基亞砜(DMSO)=9:1。

2. 取長勢(shì)良好，匯合度達(dá)80%-90%并無污染的細(xì)胞，消化離心后用1.5ml凍存液重懸后轉(zhuǎn)移至凍存管中，標(biāo)記好細(xì)胞種類、日期、操作者，放入恢復(fù)室溫的梯度凍存盒，一同放置于-80°C冰箱。

復(fù)蘇：

準(zhǔn)備好離心管中放入3ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，并確保水浴鍋打開并達(dá)到37°C，從-80°C冰箱取出目標(biāo)凍存管，放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min，與3ml培養(yǎng)基混合均勻。在1000rpm，離心5分鐘，棄去上清液，用新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，加入10cm皿中，培養(yǎng)過夜。

注意事項(xiàng)：

1.ECM細(xì)胞培養(yǎng)基又稱內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，是專門為人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)設(shè)計(jì)的最合適其生長的（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，包括必需和非必需氨基酸、維生素、有機(jī)和無機(jī)化合物、激素、生長因子、微量礦物質(zhì)和低濃度胎牛血清（5%）。

2.該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進(jìn)正常人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長。

3.嘗試過使用DMEM（高糖）培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基，考慮可能由于不含生長因子，多代后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，碎片增多。

4.ECM細(xì)胞培養(yǎng)基中的數(shù)種成分是怕光的，所以推薦培養(yǎng)基不要長時(shí)間暴露在光中。避光4°C保存，配好的培養(yǎng)基需要在一個(gè)月內(nèi)使用。

5.HCMEC/D3細(xì)胞十分耐造，正常培養(yǎng)即可。

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