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    神奇的生物素biotin

    發(fā)布時(shí)間： 2024-03-26　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1375次

    1. 什么是生物素？

    物素分子量為244.31，分子中有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素，同時(shí)可根據(jù)特殊的用途對(duì)這些試劑的化學(xué)性質(zhì)（溶解性、臂長、可剪切與否）進(jìn)行優(yōu)化，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。

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                                                                  生物素

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    2. 什么是生物素化？

    生物素化是指將化學(xué)物質(zhì)或分子與生物素（biotin）結(jié)合在一起的過程。生物素是一種水溶性的維生素，也被稱為維生素B7或維生素H，它在許多生物體的生物化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。生物素可以通過化學(xué)合成或從天然來源（如食物中）獲得。生物素化通常在生物實(shí)驗(yàn)室中用于標(biāo)記和檢測特定的分子或蛋白質(zhì)，其中生物素與待檢測的分子或蛋白質(zhì)結(jié)合，然后可以通過生物素與其他分子之間的特異性相互作用來檢測或純化目標(biāo)分子。


    3. 什么是生物素-鏈霉親和素（SA-Biotin）系統(tǒng)？

    Streptavidin是一種具有四個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，它能夠與生物素結(jié)合形成非常緊密的復(fù)合物，也是已知的非共價(jià)相互作用之一（解離常數(shù) (Kd) 約為 10x-15 mol/L）。生物素和Streptavidin之間的鍵形成非常迅速，一旦形成，它不受pH值、溫度、有機(jī)溶劑和其他變質(zhì)劑的影響。生物素與Streptavidin之間的結(jié)合非常特異，因?yàn)樗鼈冎g存在著高度親和力。這種親和力使得生物素-Streptavidin復(fù)合物成為一種非常有用的工具，用于檢測、分離和純化許多生物分子，例如蛋白質(zhì)、DNA或RNA。生物素與Streptavidin互作通常被用于許多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)記和純化技術(shù)，這種相互作用也被廣泛用于結(jié)合生物分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸）、合成分子（如熒光標(biāo)記）、生物芯片技術(shù)、免疫組化、Western blot分析和其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

    生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是能夠提高檢測靈敏度。這在很大程度上是由于鏈霉親和素的四聚體構(gòu)象。一種鏈霉親和素蛋白能夠以高親和力和選擇性結(jié)合四種生物素分子。這種多樣性能夠放大弱信號(hào)，并通過簡單的工作流程提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中中低豐度目標(biāo)的檢測靈敏度。另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的多功能性。因?yàn)殒溍褂H和素可以與多種報(bào)告標(biāo)簽結(jié)合，所以它可以很容易地結(jié)合到幾乎所有的免疫測定中。例如，鏈霉親和素的酶偶聯(lián)物廣泛用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)，而熒光標(biāo)記的鏈霉親和素，如iFluor 488鏈霉親和素，則廣泛用于細(xì)胞表面標(biāo)記、熒光細(xì)胞分選 (FACS) 和其他熒光檢測成像應(yīng)用。

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    鏈霉親和素-生物素標(biāo)記抗體相互作用的圖示

    4. 生物素標(biāo)簽的應(yīng)用

    在許多蛋白質(zhì)研究應(yīng)用中，生物素標(biāo)記（即生物素化）的蛋白質(zhì)常規(guī)用Streptavidin結(jié)合物檢測或純化，包括

    1. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)

    2. 免疫組織化學(xué) (IHC)

    3. Power Styramide 信號(hào)放大，是酪胺的替代品

    4. 免疫印跡

    5. 免疫熒光顯微鏡

    6. 細(xì)胞表面標(biāo)記

    7. 親和純化

    8. 熒光細(xì)胞分選 (FACS)

    9. 流式細(xì)胞術(shù)

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    Dynabeads 鏈霉親和素相關(guān)磁珠的應(yīng)用

    5. 生物素標(biāo)記的大致流程：

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    • 待標(biāo)記物的蛋白濃度不能過低，如若濃度過低需經(jīng)超濾濃縮等手段提高濃度至0.1mg/mL以上。
    • 一個(gè)蛋白質(zhì)可能被多個(gè)生物素標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)，生物素與待標(biāo)記物應(yīng)有合適的比例，確保標(biāo)記后不影響待標(biāo)記物的活性。推薦生物素：抗原蛋白比例為1~3：1，生物素：抗體比例為5~20：1或根據(jù)標(biāo)記試劑盒說明書推薦比例。
    • 為減少空間位阻影響，基于檢測靈敏度特異性等要求，可在生物素與被標(biāo)記物之間加入交聯(lián)臂結(jié)構(gòu)。
    • 如果偶聯(lián)基團(tuán)為氨基，待標(biāo)記物的系統(tǒng)不得含有游離的氨基（Tris,氨基酸）、載體蛋白（BSA）或者其他干擾物，若有干擾物需要用標(biāo)記緩沖液反復(fù)超濾確保其去除干凈，若采用其他基團(tuán)偶聯(lián)試劑，待標(biāo)記物系統(tǒng)亦不能有含對(duì)應(yīng)的游離基團(tuán)的物質(zhì)。
    • 如果待標(biāo)記物為分子量較小的物質(zhì)，在純化過程中注意超濾管、脫鹽柱、透析袋的截留分子量。
    • 標(biāo)記反應(yīng)后的體積量至少在100μL以上，以達(dá)到純化時(shí)的最小上樣量。
    • 標(biāo)記反應(yīng)完成后（氨基偶聯(lián)體系），可在體系中加入適量的含游離含氨基小分子物質(zhì)，中和游離的生物素活化試劑，提高純化效率，減少后續(xù)反應(yīng)的假陽性和高背景。
    • 純化后的標(biāo)記蛋白可采用A280或BCA法測定蛋白含量。
    • 標(biāo)記純化后的蛋白可根據(jù)蛋白性質(zhì)進(jìn)行分裝長期保存，減少凍融次數(shù)。
    蛋白互作中利用臨近連接法用生物素標(biāo)記互作蛋白
    可通過生物素連接酶(Biotin-protein ligase, BirA)對(duì)Avi標(biāo)簽融合蛋白或多肽快捷、高效地進(jìn)行生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記的蛋白可使用基于Streptavidin或Avidin方法進(jìn)行純化或檢測，例如使用Streptavidin磁珠對(duì)生物素標(biāo)記蛋白進(jìn)行純化，或用HRP等標(biāo)記的Streptavidin對(duì)生物素標(biāo)記蛋白進(jìn)行檢測。Avi標(biāo)簽是由15個(gè)氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)組成的短肽標(biāo)簽，在ATP和生物素存在的條件下，BirA在Avi標(biāo)簽的賴氨酸殘基上連接一個(gè)生物素，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白的生物素標(biāo)記。
    生物素連接酶BirA特異性的生物素標(biāo)記Avi標(biāo)簽有多方面的優(yōu)點(diǎn)。Avi標(biāo)簽小且對(duì)融合蛋白的影響非常小，只針對(duì)Avi標(biāo)簽上的Lys殘基進(jìn)行特定位置的生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記效率高，可重復(fù)性好；體內(nèi)或體外均可進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的蛋白與鏈霉親和素(Streptavidin)的親和力高，從而使Avi-tag技術(shù)可以應(yīng)用于目的蛋白的固定吸附、純化和檢測等；相比于傳統(tǒng)生物素化學(xué)標(biāo)記的非特異性位點(diǎn)的標(biāo)記，BirA催化的反應(yīng)條件更溫和、更簡單，對(duì)被標(biāo)記蛋白活力影響小，酶活效率高，標(biāo)記特異性強(qiáng)。

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    6. 生物素化核苷酸及oligo

    生物素修飾的三磷酸核苷類似物，如 dUTP 和 dCTP，可以通過酶促整合到 DNA 或 RNA 片段中，用于熒光原位雜交 (FISH)、DNA 陣列、微陣列和其他雜交技術(shù)。標(biāo)準(zhǔn)酶促非放射性DNA標(biāo)記反應(yīng)，包括3'末端標(biāo)記、cDNA 標(biāo)記、切口平移、PCR和隨機(jī)引物標(biāo)記。每個(gè)生物素化核苷酸在生物素與其在核苷酸上的連接點(diǎn)之間包含一個(gè) 11、14、16 或 20 個(gè)原子的間隔區(qū)。例如常見的Biotin-dATP或Biotin-dCTP被用于HiC實(shí)驗(yàn)添加到酶切口處；生物素標(biāo)記的linker(21bp dsDNA)可用于ChIAPET實(shí)驗(yàn)中連接兩個(gè)染色質(zhì)DNA片段；在RNA pull down實(shí)驗(yàn)中用生物素標(biāo)記RNA（SP6或T7體外轉(zhuǎn)錄過程中，以Biotin-16-UTP部分取代UTP，從而轉(zhuǎn)錄生成生物素標(biāo)記的RNA探針或mRNA。由于使用的RNA Polymerase對(duì)天然核苷酸(NTP)和生物素標(biāo)記核苷酸(Biotin-NTP)沒有選擇傾向性，因此每個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生物素標(biāo)記的程度可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中NTP與Biotin-NTP的比例來控制。一些試劑盒將Biotin-16-UTP的比例控制在約35%，使反應(yīng)和標(biāo)記效率之間達(dá)到較好的平衡。得到的生物素標(biāo)記的RNA探針或mRNA可使用熒光基團(tuán)、酶或抗體偶聯(lián)的鏈霉親和素(Streptavidin)進(jìn)行檢測，應(yīng)用與RNA pulldown或其他富集實(shí)驗(yàn)。）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用生物素修飾的引物合成帶有生物素標(biāo)記的cDNA；此外，RNA-seq文庫構(gòu)建中，生物素標(biāo)記的Oligo(dT)與mRNA3''端的poly A退火形成雜交體，然后用帶有鏈霉親和素的順磁磁珠洗滌并捕獲雜交體，形成雜交體－磁珠復(fù)合體，最后用磁架將此復(fù)合體捕獲；

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    7. 生物素化抗體

    在做western blot或免疫組化時(shí)常使用一抗二抗來放大、顯示抗原，用酶或熒光標(biāo)記二抗。生物素化的抗體，是在抗體上連接生物素（biotin），生物素能和親和素（avitin）特異性高親和性結(jié)合，親和力是抗原抗體結(jié)合的一萬倍，而且一個(gè)avidin可以結(jié)合四個(gè)biotin，這樣又起到級(jí)聯(lián)放大的作用。所以能更加靈敏的顯示微量抗原，這種方法也稱親和免疫組化。目前抗體蛋白標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域的分析研究與技術(shù)測定，常見的抗體標(biāo)記技術(shù)包括生物素化標(biāo)記法，酶標(biāo)記法，熒光素標(biāo)記法和膠體金標(biāo)記法。生物素化抗體標(biāo)記的樣品可應(yīng)用酶標(biāo)或熒光染料標(biāo)記的親和素或生物素-親和素復(fù)合物來檢測。生物素-SP是其6原子間隔位于生物素和其共軛的蛋白質(zhì)之間。當(dāng)生物素-SP結(jié)合抗體用于酶免疫測定時(shí)，與沒有間隔的生物素結(jié)合抗體相比，靈敏度會(huì)提高。當(dāng)生物素-SP共軛抗體與堿性磷酸酶共軛鏈維定一起使用時(shí)，這一點(diǎn)尤為明顯。顯然，長間隔將生物素部分從抗體表面延伸出去，使其更容易接觸到鏈霉親和素的結(jié)合位點(diǎn)。

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                                     生物素-SP分子。分子量454.54 Da。左22.4 ?。

    圖2. 標(biāo)記鏈酶親和素生物素法（LSAB）。A. 一抗體檢測靶抗原。B. 生物素化二抗可識(shí)別一抗。C. HRP偶連鏈酶親和素與生物素化的二抗體結(jié)合，與HRP偶聯(lián)的二抗相比，能夠顯著增強(qiáng)信號(hào)。

    8. 如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素化分子?

    鏈霉親和素-生物素相互作用是已知的蛋白與其他分子間非共價(jià)的生物相互作用。生物素與鏈霉親和素間的鍵形成非常迅速，一旦形成，就不會(huì)受到pH、溫度、有機(jī)溶劑和其他變性劑等多種因素的影響。從鏈霉親和素上分離生物素時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中使用的是生物素的衍生物或經(jīng)修飾的鏈霉親和素，那么需要特定形式和通常溫和的方法解離，除此之外通常情況下都需要非常劇烈的方法解離，并且會(huì)使鏈霉親和素變性。下面探討了其中兩種方法。

    生物素化核酸：為了從Dynabeads鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中孵育磁珠，65°C孵育5分鐘或90°C孵育2分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。有研究提到，在高溫(120C，15分鐘)下，才能在鹽溶液中解離。另外，在6 mol/L鹽酸胍溶液(pH 1.5)中也可解離；有研究指出，生物素標(biāo)記的核酸探針不能用酚抽提，否則生物素核酸會(huì)進(jìn)入酚層而損失；Holmberg等（Electrophoresis 26, 501-510, 2005）報(bào)道稱，在用離子水短時(shí)間孵育后，可將生物素化DNA從鏈霉親合素磁珠上釋放（未進(jìn)行測試）。

    生物素化蛋白質(zhì)：對(duì)于生物素化蛋白質(zhì)，則可在0.1% SDS或SDS-PAGE緩沖液中煮沸磁珠3分鐘。

    9. 鏈霉親和素磁珠結(jié)合片段的長度和結(jié)合能力為多少?

    由于具有空間位阻，因此結(jié)合能力取決于片段大小。例如，500 bp片段在Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠上的結(jié)合量是1,000 bp片段的2倍。長DNA片段會(huì)占據(jù)磁珠周圍更多空間，使其更難“找到"磁珠上的鏈霉親和素。較短的片段更易接近鏈霉親和素。對(duì)于大于2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒。該試劑盒包括Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和一種可增強(qiáng)長生物素化DNA片段（大于2kb）固定的結(jié)合液。對(duì)于大于1-2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒，因?yàn)榻Y(jié)合液可增強(qiáng)結(jié)合能力。該結(jié)合液可使DNA線性化，進(jìn)而伸展且堿基堆疊成剛性結(jié)構(gòu)（不適用于質(zhì)?；颦h(huán)狀核酸等較短的片段）。

    鹽濃度可影響生物素化核酸與Dynabeads鏈霉親和素磁珠的結(jié)合效率。對(duì)于1kb以內(nèi)的生物素化DNA片段，最佳結(jié)合條件為1M NaCl（終濃度），25℃孵育15分鐘；較長的DNA片段應(yīng)固定過夜。生物素化抗體應(yīng)在含0.1% BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中固定。由于游離生物素與Dynabeads鏈霉親和素磁珠結(jié)合的速度比大分子更快，因此應(yīng)確保樣本不含過量的游離生物素。應(yīng)使用HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸，以避免樣本中游離生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化過程都將影響磁珠的結(jié)合能力，因此，可采用滴定法優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)應(yīng)用中的磁珠使用量。

    10. Dynabeads鏈酶親和素磁珠是無RNase的嗎?

    Dynabeads鏈霉親和素磁珠不是以無RNase溶液的形式提供的。處理RNA時(shí)，應(yīng)使用DEPC處理的0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次，每次1-3分鐘。DEPC毒性很強(qiáng)。但能去除RNase。清洗后，可使用DEPC處理的0.1 MNaCl溶液重懸磁珠。"DEPC處理"是指：加入0.1% DEPC，混合，室溫下解育1小時(shí)。隨后，將DEPC處理的溶液進(jìn)行高壓滅菌，以破壞DEPC。

    11. 如何去除雙鏈DNA中的非生物素化鏈？

    可通過堿處理或高溫處理分離DNA雙鏈。采取堿處理時(shí)，可使用0.1 M NaOH洗脫非生物素化鏈。通常情況下，該處理方法不會(huì)對(duì)磁珠產(chǎn)生任何影響。在NaOH處理前，在2X結(jié)合和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。高鹽濃度將有助于減少電荷，從而使非特異性結(jié)合最小化。向Dynabeads/DNA復(fù)合物中加入新鮮配制（很重要）的0.1 M NaOH溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育2-3分鐘（最多5分鐘）。除去含有非生物素化鏈的上清液。再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。第一次洗脫時(shí)，即可洗脫下大部分DNA。除了堿處理，也可進(jìn)行加熱處理，在水中95°C加熱5分鐘即可。為防止再退火，堿處理或高溫處理后必須快速從磁珠上分離DNA，最好在冰上操作。加熱會(huì)在一定程度（在水中約為7%）上引起生物素化DNA從鏈霉親和素上解離。因此，通常更推薦采用堿處理法。

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