如何提高DNA濃度/純度測定的準確性？

分子生物學(xué)實驗中經(jīng)常需要對樣品進行濃度和純度的測定，它相當于一種質(zhì)控，以此來確保下游實驗的結(jié)果可靠。

常用的DNA濃度/純度測定設(shè)備是紫外分光光度計，它的原理是利用物質(zhì)分子對紫外可見光譜區(qū)的輻射吸收來進行分析物質(zhì)成分。

這樣來描述可能有點生硬，我們舉個栗子：

假設(shè)現(xiàn)在有一樣物質(zhì)A，它溶解在溶液內(nèi)，當光照射溶液時，溶液內(nèi)的A會吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長，A對不同顏色的光（不同波長）的吸收程度是不一樣的。

雙鏈的DNA，它能對波長為260nm的光進行強烈的吸收，吸收的程度可以用一個叫吸光度的數(shù)值來測量，濃度越高的DNA，理論上吸光度也越高。

最后，通過與標準品的吸光度數(shù)值對比后，就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。

DNA濃度測定通常會使用紫外分光光度計，常見的有NanoDrop這類設(shè)備。除了DNA，它還能測定RNA和蛋白的吸光度。

要提高濃度測定的準確性，需要注意以下幾點：

• 檢測之前，務(wù)必充分混勻DNA溶液，因為這類機器的上樣檢測體積只需要1-2uL，如果樣品沒有混勻，那么每次檢測樣品濃度也會不一樣。

• 因為上樣體積很小，所以樣品很容易揮發(fā)，如果把樣品加在檢測基座后不馬上檢測的話，會導(dǎo)致測出來的樣品濃度偏高。

• 實驗環(huán)境和耗材的穩(wěn)定性要高。檢測設(shè)備應(yīng)該在放置在溫度可控、通風的環(huán)境下；裝樣品的管子如果不是要進行吸取樣品操作的話，需要時刻緊閉。

• 每次檢測完畢，都需要對檢測基座或者比色皿進行清洗和擦拭，確保不會有樣品殘留后，再進行下一次上樣檢測。

• 空白調(diào)零，應(yīng)該使用溶解待檢測樣品的溶液來調(diào)零。例如如果用水溶解DNA，那就用水調(diào)零，用其他緩沖液溶解，則用對應(yīng)的緩沖液調(diào)零。

在測定后，我們通常會看到，設(shè)備會提供幾個不同的結(jié)果給我們，有的是數(shù)值，例如OD230、OD260，有的是比值，例如OD260:280，那這些結(jié)果代表什么呢？

OD是optical density(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收的光密度。

OD=lg(1/trans)，其中trans為被測物質(zhì)的透光值。

不同的OD以及OD比值，代表不同的意義：

【OD230】

提取核酸時會用到各種化合物，它們以鹽離子的形式存在，例如胍鹽、苯氧基離子、硫氰酸酯。

這些鹽離子對230nm波長的紫外光有強烈的吸收值。如果測定核酸時，發(fā)現(xiàn)OD230數(shù)值很高，代表溶液中的鹽離子濃度很高。

【OD260】

雙鏈DNA在這個波長下會對光有強烈的吸收。

【OD280】

芳香族氨基酸在這個波長下，有強烈的光吸收。如果該數(shù)值很高，代表DNA溶液中可能存在蛋白質(zhì)的污染.

【OD320】

通常是由光散射造成的。如果該數(shù)值很高，意味著溶液內(nèi)有顆粒物污染、待檢器皿例如比色皿有污漬。

【OD260:OD280】

通常用于判斷DNA或RNA溶液的純度。常用的指標是：在OD230數(shù)值較低，OD320數(shù)值較低的前提下。較高純度的DNA，比值應(yīng)該為1.7～1.9之間，較高純度的RNA，比值應(yīng)該為1.9～2.0之間。

當然，以上測定的結(jié)果并非是絕對計數(shù)的數(shù)值，它是一個參考數(shù)值，因為我們在測定時是不涉及用到標準品這樣?xùn)|西，所以，也就是我們測出來的數(shù)可以作為一定程度的參考。

而且，當一些外界因素影響時，測定也會出現(xiàn)偏差，例如樣本含量非常非常低時，測定的數(shù)值誤差就會很高并不具參考意義，設(shè)備耗材出現(xiàn)問題時，測定的數(shù)值也會不準。

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