質(zhì)粒圖譜

質(zhì)粒圖譜為質(zhì)粒DNA序列的物理圖譜，提供了包括質(zhì)粒的大小、篩選標(biāo)記、克隆位點、轉(zhuǎn)錄及翻譯元件等信息，為我們選擇質(zhì)粒、了解質(zhì)粒特點及應(yīng)用提供了重 要依據(jù)。對于初學(xué)者來說該如何去閱讀質(zhì)粒圖譜呢？今天來給大家講解一下如何閱讀質(zhì)粒圖譜及構(gòu)建質(zhì)粒圖譜。

質(zhì)粒的組成要素有哪些

1. 復(fù)制起始位點：Ori即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復(fù)制起點。而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點。
   

2. 抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ,Kan+。

3. 多克隆位點MCS：克隆攜帶外源基因片段。

4. P/E 啟動子/增強(qiáng)子

5. Terms 終止信號

6. 加poly（A）信號：可以起到穩(wěn)定mRNA作用

如何閱讀質(zhì)粒圖譜

第一步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）。

第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

1.Ampr 水解 β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

2.tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

3.camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

4.neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使 G418（卡那霉素衍生物衍生物）失活。

5.hygr 使潮霉素 β 失活。

第三步：看多克隆位點（MCS）。

它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。

質(zhì)粒一般只能容納小于 10 Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。

這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用哪種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號

啟動子－促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 順序，這個 DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點/起始密碼/ SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結(jié)合位點，對于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號。

第六步：質(zhì)粒圖譜上的箭頭。

 有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

質(zhì)粒構(gòu)建以及需要注意的事項：

1.載體構(gòu)建

 載體構(gòu)建(vectorconstruction)：載體構(gòu)建是分子生物學(xué)研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點（MCS）的改造和已有載體啟動子、增強(qiáng)子、篩選標(biāo)記等功能元件的改造。是為把DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種能進(jìn)入細(xì)胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。載體構(gòu)建即是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒。

 特點：當(dāng)給質(zhì)粒插入一段外源DNA片段后，它依然能夠進(jìn)行自我復(fù)制。

2.多克隆位點

 多克隆位點（multiple cloning site, MCS），指的是包含數(shù)個（最多20個）限制性酶切位點（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列。MCS上含有多個單一酶切位點，是外源DNA的插入部位，每個限制性酶切位點通常是十分奇特的，即它們在一個特定的載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。不同酶的酶切位點可有重疊。單一酶切位點就是只有一種特定的酶能夠識別并進(jìn)行酶切的位點，多克隆位點一般是位于質(zhì)粒上的一段序列，這段序列含有很多個酶切位點，但這些酶切位點每一個都被一種酶識別并酶切。

3.質(zhì)粒構(gòu)建

（1）質(zhì)粒構(gòu)建原理

質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中經(jīng)常使用的實驗技術(shù)。原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)。

（2）質(zhì)粒構(gòu)建方式

質(zhì)粒構(gòu)建方式多樣，常規(guī)的T4連接酶，下面就介紹下T4連接酶構(gòu)建質(zhì)粒方法，T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接，但一般推薦適用黏性末端。

（3）質(zhì)粒載體的制備

質(zhì)粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切，一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個，盡量使載體的末端具有特異性，防止自連。

圖 質(zhì)粒圖譜

4.一般目的基因用于克隆表達(dá)的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

   （1）選擇質(zhì)粒上兩個酶切位點的距離不應(yīng)小于太?。?gt;10bp），否則影響限制性內(nèi)切酶對切點的識別，不利于空載體的雙酶切；

    （2）一般目的基因用于克隆表達(dá)的情況下，酶切位點的選擇要考慮到：

目的基因片段內(nèi)部不含有所選的酶切位點（不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷）。

（3）實驗后繼應(yīng)用的所有載體（真核、原核、酵母、昆蟲）都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確（定向克隆）。（不然換載體表達(dá)時，還要重新設(shè)計引物，以引進(jìn)新的酶切位點）。

（4）盡可能選比較常用的酶切位點（常用切點酶的價格比較便宜）。

（5）兩個酶切點至少隔上3個堿基。

（6）兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切。

（7）最好使用酶切效率高的酶。

（8）最好使用雙酶切有共同buffer的酶。

注：質(zhì)粒構(gòu)建完成后可利用PCR原理進(jìn)行測序驗證。

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