細(xì)胞凍存相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作詳解

一個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來(lái)。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時(shí)有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過(guò)程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。

細(xì)胞冷凍過(guò)程有四個(gè)要點(diǎn)：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲(chǔ)存環(huán)境。

用來(lái)凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時(shí)候，這時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時(shí)換一次培養(yǎng)液。收獲用來(lái)凍存的細(xì)胞開(kāi)始時(shí)方法和平時(shí)一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的最終細(xì)胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬(wàn) 細(xì)胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。

細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對(duì)特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時(shí)使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會(huì)好些。保護(hù)劑在使用時(shí)先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。

細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過(guò)度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個(gè)小時(shí)，再放入 -80℃冰箱過(guò)夜(如果沒(méi)有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長(zhǎng)期保存。

細(xì)胞長(zhǎng)期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時(shí)引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲(chǔ)少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。

●  化凍過(guò)程的原則是要讓凍存的細(xì)胞快速融化。

●  如果細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮液面下，使用者最好準(zhǔn)備好必要的防護(hù)器具(至少要戴上護(hù)目鏡，最好戴上面罩和較厚的手套)，防止進(jìn)入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害。從冰箱或液氮罐取出細(xì)胞后將凍存管放37℃水浴輕輕晃動(dòng)使之化凍*，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。

●  由于大多防凍劑與細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間接觸時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒害，所以最好盡快除去細(xì)胞凍存時(shí)加入的防凍劑。

●  防凍劑的去除方式和細(xì)胞的敏感性有關(guān)。有些細(xì)胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長(zhǎng)，可以直接將化凍的凍存細(xì)胞連同其凍存液加入預(yù)備好15-20ml

培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后換培養(yǎng)液。

●  對(duì)于敏感細(xì)胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。