CO-IP實驗操作及注意事項

原理：

 CO-IP（免疫共沉淀）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。

 從原理示意圖可見，免疫共沉淀利用抗原（紅三角）與蛋白 (藍圓柱) 的特異性結(jié)合，再通過連接著樹脂的抗體 (紫圓球) 去識別抗原，從細胞裂解液或者蛋白混合物中捕獲與抗原相作的蛋白。之后通過進一步洗脫，獲取抗原-蛋白復(fù)合物，再對蛋白進行檢測。

一、蛋白樣品制備

裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白樣品，以下為HEK293T細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻。

單層貼壁細胞總蛋白的提取：

1、收集細胞：10cm細胞培養(yǎng)板上，每板細胞加1ml ，4℃預(yù)冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。反復(fù)沖洗把所有掛壁細胞洗下來轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管內(nèi) 離心：3400 rpm 2min。

2、清洗細胞：棄上清，（大槍頭套小槍頭）避免吸到沉淀。再加1mPBS，垂懸吹打；離心：rpm3400 2min。棄上清，將PBS吸凈后-80℃保存。

3、準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。

4、裂解蛋白，收集的細胞中加入1000ul細胞裂解液10ul蛋白酶抑制劑，冰上靜置30min，每10min震蕩混勻一次，4℃，12000rpm離心10min，收集上清液。

5、 每1 ml 總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃1 h以去除非特異性雜蛋白，降低背景。

6、4℃，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中標(biāo)號Input，留Protein A珠子，標(biāo)號IP。

7、變性以及還原蛋白

室溫溶解蛋白上樣緩沖液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合，IP組加入50ul蛋白上樣緩沖液，在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩沖液，100℃加熱煮沸，以充分變性蛋白。冰上驟冷，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可。

二、經(jīng)過SDS-PAGE分離樣品

膠的選擇與制備（根據(jù)目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）

1、凝膠的制備:根據(jù)目的蛋白的大小來選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 k Da選擇12%~15%的分離膠;大于20 k Da選擇10%的分離膠, 濃縮膠一般固定為5%。

2、上樣加入蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預(yù)染的marker。

3、加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恒壓電泳，約30min,當(dāng)指示劑溴酚藍進入分離膠后改用90V恒壓電泳，當(dāng)指示劑到達距凝膠下端約0.5cm處時關(guān)閉電源，取出膠板。

（注意：上樣時間盡量短，避免樣品擴散，但也不能過快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液）

三、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育

將蛋白凝膠中的蛋白，通過電流作用轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。

1、將剪好的PVDF膜用無水甲醇潤濕30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中5min后開始后續(xù)操作。

2、裝配轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)（在轉(zhuǎn)移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產(chǎn)生）

黑面（負極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉(zhuǎn)印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然后將三明治轉(zhuǎn)移至電泳槽中，黑面對黑面。

3、加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，將電轉(zhuǎn)儀置于冰水中，300mA恒流轉(zhuǎn)膜60-90min。

4、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，使用5% 脫脂奶粉室溫封閉1h。

5、選擇合適的一抗孵育，室溫搖動1h。

6、孵育二抗，4℃孵育2h或室溫（22-25℃）搖動孵育1h。（抗體查相應(yīng)說明書確定稀釋倍數(shù)）

四、顯影

1、配置稀釋液，將A液和B液按照（1：1）混合。

2、從TBST緩沖液中取出膜，去除膜上的多余緩沖液，但不要讓膜干燥。

3、將有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張紙板上，加上配好的工作稀釋液。用量以覆蓋住膜為基準(zhǔn)。

4、將膜與工作稀釋液孵育1-5min,確保整個表面覆蓋。

5、去除多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中X膠片感光顯影定影。

注意：

1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。

2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入 H2O2。

3、DAB 有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。

五、注意事項

1、上樣時，要迅速，避免樣品擴散，也不能讓樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染。

2、全程操作中戴手套，不要用手觸膜。

3、如檢測小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2µm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。

4、 某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。

5、如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。

6、曝光時。去除膜上的多余緩沖液，但不要讓膜干燥，顯影液要現(xiàn)用現(xiàn)配。

7、PVDF 膜上一抗二抗可以使用洗脫液洗脫，重新孵育一抗二抗。

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